一、免疫组织化学 (IHC-Fr)-冷冻切片切割技术

冷冻切片：切片经 3-氨基-丙酯-三-乙氧基-硅烷（APES）包被玻片封固后，最好在 -80°C下保存，需要时再取出。

1.需要时取出后室温恢复 5 分钟。

2.-20°C 预冷固定剂（丙酮、甲醇或乙醇）30 分钟。（首推丙酮）

3.冷固定剂室温固定 5-10 分钟。

4.PBS 漂洗 3×4 分钟。

5.参照手册继续染色。

非醛类固定时不需进行抗原修复步骤。但是如果冷冻组织或细胞经福尔马林固定，就需要进行抗原修复。但易碎的样本，如大脑组织或会影 响结果。下面的参考文献介绍了将切片放置在玻片上之前怎样用 3-氨基-丙酯-三-乙氧基-硅烷 (APES) 处理玻片。这种处理方法能提高粘附力， 使抗原热修复对组织形态的损害降到最低：

Warembourg M, Leroy D., Microwave pretreatment of sections to improve the immunocytochemical detection ofprogesterone receptors in the guinea pig hypothalamus. J Neurosci Methods. 2000 Dec 15;104(1):27-34.

关于冷冻组织切片抗原修复更加深入的讨论见下面的参考文献。

Yamashita S, Okada Y. Application of heat-induced antigen retrieval to aldehyde fixed fresh frozen sections. J HistochemCytochem. 2005 Nov;53(11):1421-32.

如果组织样品是醛类固定剂如福尔马林、多聚甲醛、戊二醛等固定的或用免疫荧光法检测的，在加一抗之前用含 0.3M 甘氨酸的封闭液封闭。因为甘氨酸能结合自由醛基，而这些醛基会与一抗和二抗结合造成高背景染色。使用多聚甲醛或戊二醛固定时，由自由醛基导致的高背景很有可能发生。

IHC-石蜡操作指南中 (IHC-P) 有关于显色和荧光检测石蜡技术的详细介绍。

二、免疫细胞化学 (ICC) 指南一般步骤

1.加盖玻片，聚氮丙啶或多聚左旋赖氨酸室温作用 1 小时。

2.灭菌水漂洗盖玻片 3×5 分钟。

3.盖玻片彻底干燥后，紫外灯灭菌至少 4 小时。

4.玻璃盖玻片上种上细胞，或制作细胞样本或涂片标本。

5.磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗。

固定

1.冷甲醇、丙酮固定样品 1-10 分钟，或含 3-4% 多聚甲醛 pH 7.4 的 PBS 室温固定 15 分钟。

2.冷PBS冲洗样品2次。

通透

如果靶蛋白是细胞内表达的，那么使细胞膜变通透就很重要了。注：丙酮固定的样品不需要通透。

3.将样品在含 0.25% Triton X-100（或 100μM 洋地黄皂苷或 0.5% 皂角苷）的 PBS 中孵育 10 分钟。Triton X-100 是最常用的去

污剂，能增 强抗体的穿透力。因为它对细胞膜有损坏作用，因此不适用于与细胞膜结合的抗原。

4.PBS 冲洗细胞 3×5 分钟。

封闭及孵育

5.细胞在含1%BSA的PBST（封闭液也可以选择含1%明胶或10% 与二抗同种动物来源的血清）中孵育30分钟，以阻断抗体的非特异性结合。

如果组织样品是醛类固定剂如福尔马林、多聚甲醛、戊二醛等固定的或用免疫荧光法检测的，在加一抗之前用含 0.3M 甘氨酸的封闭液封闭。因为甘氨酸能结合自由醛基，而这些醛基会与一抗和二抗结合造成高背景染色。使用多聚甲醛或戊二醛固定时，由自由醛基导致的高背景很有可能发生。

IHC-石蜡操作指南中 (IHC-P) 有关于显色和荧光检测石蜡技术的详细介绍。

6.细胞与抗体（含 1% BSA 的 PBST 稀释）在湿盒中共同孵育，室温 1 小时，或 4°C 过夜。

7.弃去液体，用 PBS 冲洗细胞 3×5 分钟。

8.细胞与二抗在 1% BSA 中孵育，室温 1 小时，避光。

9.弃去二抗溶液，并用 PBS 冲洗细胞 3×5 分钟，避光。

复染

10.在 0.1-1μg/ml Hoechst 或 DAPI（DNA 染色剂）中孵育细胞 1 分钟。

11.PBS 冲洗。

封固

12.向盖玻片上滴加一滴封固液封固。

13.用指甲油密封盖玻片防止变干并移至显微镜下观察。

14.-20°C 或 +4°C 避光保存。