IHC/ICC 中的固定和通透技术

固定：

固定就是保持抗原细胞和亚细胞结构固定不动，同时又能使抗体进入到细胞和亚细胞的所有部位。固定和通透方法的选择取决于抗原表位和 抗体本身的灵敏性，有时需要优化。

固定时可使用一些交联试剂，如多聚甲醛，有利于保护细胞结构，但是可能会降低一些细胞成分的抗原性，因为交联阻碍了抗体结合。鉴于 此，可采用抗原修复技术，尤其是固定孵育时间较长时或使用高百分比的交联度固定剂时。另外一种选择就是使用有机溶剂，但是它们会吸 去脂类使细胞脱水，同时会使蛋白沉淀在细胞架上。

1.4% 多聚甲醛

向玻片滴加 4% 多聚甲醛，维持 10 分钟。

用 PBS 或含 1%BSA 的 PBS 冲洗细胞。

(注意：在多聚甲醛中固定时间超过 10-15 分钟会造成蛋白交联，或许需要通过抗原修复技术来修复此交联位点，

以确保抗体能自由结合并检测到该蛋白。）

2.乙醇

向玻片滴加 100-200μl 预冷的 95% 乙醇，5% 冰醋酸，维持 5-10 分钟。

用 PBS 或含 1%BSA 的 PBS 冲洗细胞。

3.甲醇

向玻片滴加 100-200μl 的冷甲醇。 -20°C 维持 10 分钟。

用 PBS 或含 1%BSA 的 PBS 冲洗细胞。

（注意：甲醇有通透作用。一些抗原表位对甲醇非常敏感，能破坏抗原表位结构。因此，如果需要通透，可用丙酮代替甲醇。）

4.丙酮

向玻片滴加 100-200 μl 的冷丙酮。 -20°C 维持 5-10 分钟。

用 PBS 或含 1%BSA 的 PBS 冲洗细胞。

（注意：丙酮也有通透作用，因此，不需要进一步通透。)

通透：

通透技术仅用于抗体需进入细胞内检测蛋白时，包括细胞内蛋白和抗原表位位于胞内区的跨膜蛋白检测。

溶剂：

1.丙酮固定也有通透作用。

2.甲醇固定也可通透，但不是总适用。

这些反应试剂都可用来固定和通透，也可在交联剂如多聚甲醛固定后再使用。

去污剂：

1.Triton 或 NP-40

含 0.1-0.2% Triton 或 NP-40 的 PBS 洗涤 10 分钟。

这些去污剂同样也能溶解部分核膜，因此非常适合于核抗原染色。

(注意：因为这些都是强去污剂，因此当使用浓度较高或作用时间较长时会破坏蛋白，影响染色效果）

2.吐温-20，皂角苷，洋地黄皂苷和 Leucoperm。

用0.2-0.5% 洗涤 10-30 分钟。

这些是较温和的细胞膜溶剂。它们会使细胞膜产生足够大的孔，促使抗体进入细胞内而不用溶解胞膜。适合于胞浆内抗原质膜的

胞浆表面抗 原和可溶的核抗原。

特别建议：

用丙酮、乙醇或甲醛（高浓度）固定细胞骨架、病毒和一些酶抗原，可获得理想的结果。

位于细胞器和胞浆颗粒上的抗原，其固定和通透方法的选择取决于抗原本身，需尽量保留表位。