一、直接ELISA操作步骤

常规程序

包被抗原

1.用 PBS 或碳酸盐缓冲液稀释抗原至终浓度 20μg/ml。用吸管吸取 50μl 稀释抗原到 PVC 微孔板上，按要求往后进行系列稀释。

(样品纯度较高时通常在酶标板上稀释到不少于 2μg/ml。

不一定用纯化的溶液，不过，一般在试验样品中目的蛋白（抗原）含量需大于 3%。

抗原的蛋白浓度在酶标板上应该不高于 20μg/ml，此时已经足够中和酶标板上的位点了。

确保抗原的浓度在抗体可以检测到的范围内。)

2.在酶标板上覆盖封口膜，室温孵育 2 小时，或者 4°C 过夜。包被的孵育时间需要优化。

3.倒掉孵育溶液，用 PBS 每孔 200μl 洗板 2 次。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。

封闭

4.用 200μl 含 5% 脱脂奶粉或含 5% 血清的PBS缓冲液封闭酶标板上剩余的蛋白结合位点。或者用其他封闭剂如 BlockACE、BSA（牛血清蛋 白）代替。

5.用封口膜覆盖酶标板室温至少孵育 2 小时，或者 4°C 过夜。

6.用 PBS 洗板 2 次。

加抗体孵育

7.加入 100 μl 抗体，稀释到最佳浓度（参照说明书），使用前用封闭液现配。

8.用封口膜覆盖酶标板室温孵育 2 小时，该孵育时间需要进行优化。尽管 2 小时的孵育通常可以获得足够强的信号，但如果获得的信号较弱 时，通过 4°C 孵育过夜通常可以获得较强信号。

9.用 PBS 洗板 4 次。

检测

10.用多通道吸液器向每孔加入 100μl（或 50μl）底物。

11.显示出足够深的颜色之后，再向每孔加终止液 100μl（如果必须）。

12.用酶标仪读每个孔的吸光度值（光密度）。

注意：一些酶作用物是有害的(致癌物)，因此必须小心操作并佩戴手套。

数据分析

根据连续稀释的数据制作一条标准曲线，x 轴为浓度（对数转换），y 轴为吸光度值（线性）。将样品吸光度值代入标准曲线求出浓度。

二、夹心 ELISA

夹心 ELISA 用两种抗体协同测定抗原的含量（例如：捕获抗体和检测抗体）。抗原必须包含至少 2 个能被抗体识别的抗原位点才能被检测 ，因为至少有 2 个抗体参与到这个试验中。

在夹心 ELISA 中，单克隆抗体和多克隆抗体都可以被用作捕获和检测抗体。单抗识别单一的抗原表位，可以区别抗原的微小差别使抗原得到 更精确地检测和定量。多克隆抗体通常被用作捕获抗体,以捕获尽可能多的抗原。

夹心 ELISA 的优势是样品在分析前不需要纯化, 检测灵敏度高（灵敏度是直接法或间接法的 2-5 倍）。

注意事项：

夹心 ELISA 的步骤很难优化，试验中应使用测试过的配对抗体。这样可以确保在不干扰其他抗体结合的情况下，检测目标蛋白上相应的不同 抗原表位。因此对于没有做过特定测试试验的抗体，我们不能确保我们的抗体可以用于夹心 ELISA。请参阅抗体说明书有关抗体测定应用的信息。

常规步骤：

包被捕获抗体

1.用碳酸盐/重碳酸盐缓冲液 (pH7.4) 稀释捕获抗体至浓度 1-10μg/ml，包被酶标板。

如果使用了没有纯化的抗体（例如:腹水或抗血清），可能需要通过提高样品蛋白浓度（试一下 10μg/ml），来补偿特定抗体数量较低的问题。

2.用封口膜覆盖酶标板,于 4°C 孵育过夜。

3.倒掉包被液，用 PBS 每孔 200μl 洗板 2 次。在水池上轻甩倒掉洗液，在纸巾上轻拍酶标板除去残留液体。

封闭和加样品

4.封闭包被后孔内残留的蛋白结合位点,每孔加 200μl，含 5% 脱脂奶粉的 PBS 封闭液。

5.用封口膜覆盖酶标板，室温孵育至少 1-2 小时或者如果方便的话，4°C 孵育过夜。

6.每孔加 100μl 适当稀释的样品。在精确定量测定时，通常将未知浓度样品与阳性对照标准曲线相比较，每块板都要带标准（做平行或者三 份）和空白对照以保证精确性。37°C 孵育 90 分钟。

(对于定量检测，标准品的使用浓度应覆盖抗体结合的大部分动态检测范围。您可能需要优化标准品的浓度使用范围，

以确保得到一个合适的标准曲线。为了精确定量，样品和标准通常做 2 份或 3 份。)

7.倒掉样品,每孔用 200μl PBS 洗板 2 次。

用检测抗体和二抗先后进行孵育

8.每孔加入 100μl 稀释好的检测抗体

(确保检测抗体与包被抗体识别目标蛋白上不同的抗原表位，这防止了抗体结合的冲突，

保证第二个抗体结合位点可以用来结合，尽可能的使用测试过相匹配的配对抗体。)

9.用封口膜覆盖酶标板，室温孵育 2 小时。

10.用 PBS 洗板 4 次。

11.加入 100μl 标记二抗，使用前用封闭液快速稀释至最佳浓度（根据说明书）。

12.用封口膜覆盖酶标板,室温孵育 1-2 小时。

13.用 PBS 洗板 4 次

检测

虽然许多种类的酶都可以用来检测，但辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (AP) 在 ELISA 实验中是被广泛应用的两种酶。我们必须要考虑 到一些生物原料本身具有很高水平的酶活性（例如肺泡细胞中高含量的AP,红血球中高含量的过氧化物酶），这可能导致不精确的结果。如 果有必要的话，用左旋咪唑（针对 AP）或含 0.3% 双氧水溶液的甲醇（针对过氧化物酶）进行一个附加的封闭处理。

AP 底物

pNPP（对硝基苯基磷酸盐）是最广泛使用的底物。室温下孵育 15-30 分钟后，硝基酚的黄颜色可以在 405nm 下被检测出（这一

反应可以通 过加入适当量的 0.75M 氢氧化钠溶液来终止）。

HRP 显色剂

HRP 的底物是过氧化氢，反应中，过氧化氢分解使氢供体氧化产生颜色变化。

TMB (3,3’,5,5’-四甲基对二氨基联苯)加 TMB 溶液至每孔，孵育 15-30 分钟，加适量终止液（2M 硫酸），在 450nm 下读取吸光度值。

OPD (邻苯二胺盐酸盐)终产物在492nm下检测。需要注意的是这种底物对光敏感，因此需要避光保存。

ABTS (2,2’-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)磷酸氢二铵盐)终产物是绿色的，在 416nm 测定吸光度值。

(注意：一些酶作用物是有害的(致癌物)，因此必须小心操作并佩戴手套。)

14.使用多通道移液器每孔加入底物溶液 100μl（或 50μl）。

数据分析： 根据连续稀释的数据制作一条标准曲线，x 轴为浓度(对数转换)，y轴为吸光度值(线性)。将样品吸光度值代入标准曲线

求出浓度。