NO作为一种简单的信号分子，广泛存在于各生物体组织中。NO有非常活跃的氧化还原特性，赋予了它独特，重要的生理功能，NO可以与蛋白质特定位点的半胱氨酸上的巯基残基特异性的共价结合，发生S-亚硝基化修饰作用，得到S-亚硝基巯基，从而进一步调节目标蛋白的结构和活性。

大量研究结果证实，蛋白质S-亚硝基化在生物体内具有很多重要的生理学作用，亚硝基化蛋白产物在多种疾病中表现出异常升高和降低，关节炎、支气管肺炎、糖尿病、多种硬化症、中风等疾病中蛋白质巯基亚硝基化产物较正常水平明显增多；在哮喘、新生儿血氧不足、肺气肿等疾病中蛋白质巯基亚硝基化产物较正常水平明显降低。

S-亚硝基化蛋白检测：

鉴于蛋白的S-亚硝化在诸多疾病中的广泛生理学作用，对样本中的S-亚硝化蛋白水平进行准确检测就显得尤为重要了，在这里，艾美捷给您带来了一款大家都在用的S-亚硝化蛋白检测试剂盒（Cat# 10006518），该试剂盒基于经典的生物素转换原理，将-S-NO转化为S-C-Biotin，再通过检测生物素来表征-S-NO，该试剂盒使用简单、方便、用时短，样品可直接用于WB检测和IF检测，在Nature Cell Biology，Nature Communication，Cancer Research等众多高分杂志上被引用。

检测原理：1. 封闭样本蛋白上游离的巯基； 2. 样本蛋白上S-亚硝基巯基被还原生成与马来酰亚胺生物素共价标记的游离硫醇； 3. 随后用亲和素偶联试剂检测生物素标记的蛋白。

将样本中S-亚硝基化蛋白带上生物素标记之后，该试剂盒提供了2种表征S-亚硝基化蛋白的方法：

1、类似于WB的方法：用链霉亲和素标记的HRP去定位生物素标记的蛋白，然后再用HRP的底物进行检测，适合于检测细胞/组织裂解液中的S-亚硝基化蛋白。

2、类似于IHC/IF的方法：这种方法也是将蛋白上的S-NO基团用生物素取代，然后用链霉亲和素标记的荧光素进行定位检测，只是样本处理方法跟WB法不太一样，此方法适合于检测细胞/组织切片中的S-亚硝基化蛋白。

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10006518使用过程中的常见问题（FAQ）：

1、在S-亚硝化蛋白检测试剂盒（Cat# 10006518）检测过程中，是否有哪个步骤可以暂时中止实验然后将样本过夜保存？

是的，可以在样品制备部分（Sample Preparation）下的Step 7或Step 13两个步骤中，在丙酮将蛋白沉淀后即可暂时中止实验，然后将沉淀物在-20°C下过夜保存。

2、如果没有暗室，在间接光照下进行Step 1-12可以吗？

如果没有暗室，您可以关闭实验室中的部分顶灯，并避免在工作台上开灯直射。

3、试剂盒说明书中，只有针对于细胞样本的处理方案，没有针对于完整组织的方案，完整的组织能用这个试剂盒吗？

对于软组织样本，可以分离细胞：分离，洗涤和沉淀细胞，按Step 3裂解细胞并封闭游离巯基。对于硬组织样品，在20mM Tris pH 8.0或P-SNO细胞裂解液（Buffer A）中制备0.1g/ml缓冲液匀浆。离心（1000xg，10min）除去大的细胞碎片。如果需要进一步匀浆处理，将上清至于-20℃孵育1h，再将冰冷的上清液重复匀浆化或者超声处理（确保完全裂解，通过显微镜检查是否剩余完整细胞）。如果需要，定量蛋白质浓度并稀释至2mg / mL，将复溶的封闭试剂(1ml储备液)以1:9的比例加入到当前的样品中，此时的样品可视作Step 4中细胞裂解液。

4、这个试剂盒是可以用含有β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液吗？

是的，这个试剂盒可以用含有β-巯基乙醇的Laemmli缓冲液，β-巯基乙醇不会影响蛋白上标记的生物素。

5、这款S-亚硝基化蛋白质检测试剂盒适用的样品类型有哪些了？

这款试剂盒适用的样本类型有：培养的细胞、血细胞沉淀、纯化的蛋白质。如果样本是纯化的蛋白质，首先需要将蛋白质样品在含有封闭试剂的Buffer A中重新配制成2mg / ml; 这个浓度将使封闭试剂过量。此时，蛋白质上的游离巯基将被封闭，然后可以继续Step 6中丙酮沉淀步骤。对于凝胶分析，每个泳道加载1-5μg蛋白质就可以，以避免加载过量的蛋白质。

部分引文赏析：

1.Li, L., Zhu, L., Hao, B., et al. iNOS-derived nitric oxide promotes glycolysis by inducing pyruvate kinase M2 nuclear translocation in ovarian Oncotarget 8(20), 33047-33063 (2017).

2.Lee, W.-B., Kang, J.-S., Choi, W.Y., et al. Mincle-mediated translational regulation is required for strong nitric oxide production and inflammation resolution. Nat. Commun. 7, 11322 (2016).

3.Vatolin, S., Phillips, J.G., Jha, B.K., et al. ;Novel protein disulfide isomerase inhibitor with anticancer activity in multiple myeloma. Cancer Res. 76(11), 3340-3350 (2016).

4.Salanova, M., Schiffl, G., Gutsmann, M., et al. Nitorsative stress in human skeletal muscle attenuated by exercise countermeasure after chronic disuse. Redox Biol. 1, 514-526 (2013).

5.Park, Y.-J., Yoon, S.-J., Suh, H.-W., et al. TXNIP deficiency exacerbates endotoxic shock via the induction of excessive nitric oxide synthPLoS Pathog. 9(10), e1003646 (2013).

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