前情回顾：Caspase酶系列1：底物及抑制剂

       上一期给大家介绍了Caspase酶家族及其对应的底物和抑制剂，然后就有小伙伴问小艾：你们有各种Caspase酶活性检测的试剂盒吗？小艾不喜欢吹牛，但是还是想说那句话：你想要的我们都有。今天就给同学们介绍几款Caspase酶的活性检测试剂盒：

 

        1. 基于活细胞Caspase酶活性检测：

 

      Cell Meter™ Caspases酶活性测定试剂盒提供了一种强大而便捷的方法来测量活细胞中的Caspases酶活性。这些测定法利用含有识别位点的可渗透细胞的底物来测量Caspases 3和7，Caspases 8或Caspases 9的活性，以及可以同时测量四种Caspases的多重检测试剂盒。

 

      Cell Meter™ Caspases酶活性测定试剂盒检测原理：Caspases识别序列的结合抑制了荧光团或生色团产生可量化信号的能力。在适当的活化的Caspases酶的存在下，将荧光团或发色团从识别序列上切割下来，并自由地产生指示凋亡的明亮的荧光或颜色信号。该测定对于其各自的活化的胱天蛋白酶高度特异性的。检测过程无需清洗的步骤，Cell Meter™半胱天冬酶活性测定试剂盒可轻松应用于高通量筛选。

 

 

      图1. Jurkat细胞中Caspase活性的检测。当天将Jurkat细胞以200,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。用星形孢菌素以1mM的终浓度处理细胞4小时（红色），而未处理的细胞用作对照（蓝色）。加入单半胱天冬酶测定上样溶液（100 µL /孔）（对于Caspase 3/7，在＃1中；对于Caspase 8在＃2中；对于Caspase 9，在＃3中）；或三重半胱天冬酶测定上样溶液（对于caspase 3，＃4一起添加/ 7、8和9），并在室温下孵育1小时。使用FlexStation荧光酶标仪在指定波长下测量荧光强度。Caspase 3 / 7、8和9的活性可以在一次测定中检测到，而不受其他Caspase的干扰。

 

       用于测定活细胞种Caspases 3、7、8和9活性的试剂盒：

 

 

       2. 基于溶液的Caspase 3/7活性检测

 

      Amplite™Caspase 3/7活性测定试剂盒提供了一种简单而强大的方法来测量细胞提取物和纯化的酶制剂中的caspase 3和7。该测定使用含有对Caspase 3/7具有特异性的DEVD识别序列的底物。DEVD识别序列与荧光结合导致所连接的荧光团或发色团不发光。在Caspase 3/7的存在下，荧光团或发色团从DEVD序列上切割下来，并自由产生明亮的荧光或表示凋亡的彩色信号。

 

       荧光法Caspase 3/7活性测定试剂盒组分包括：

 

      Caspase 3/7底物（200X储备溶液）

      Caspase 3/7抑制剂

      分析缓冲液

      DTT（还原剂）

 

 

      图2.使用Amplite™荧光Caspase 3/7分析试剂盒检测Jurkat细胞中Caspase 3/7活性。当天，将Jurkat细胞以80,000个细胞/孔/ 90 µL的浓度接种在96孔板中。用/不用20 µM喜树碱处理细胞5小时，用/不用5 µM的Caspase 酶抑制剂AC-DEVD-CHO处理细胞10分钟。加入Caspase 3/7测定溶液（100μL/孔），并在室温下孵育1小时。在Ex / Em ＝ 350 / 450nm下测量荧光强度。

 

       用于测定溶液样本的Caspases 3/7活性的试剂盒：

 

       3. Caspase酶结合检测

 

      在凋亡过程中，关键事件之一是Caspase酶的激活，这对于凋亡的启动很重要。Cell Meter™活细胞Caspase酶结合试剂盒使用可透过细胞且无毒的荧光指示剂来检测caspase 1、2、3 / 7、6、8、9、10和13的活性。一旦与Caspase酶结合，荧光试剂就保留在细胞内。结合事件阻止了胱天蛋白酶的进一步催化反应，但不会阻止凋亡的进行。Caspase结合试剂盒适用于荧光显微镜，流式细胞仪和荧光酶标仪。该试剂盒提供所有必需成分，并具有优化的测定方案，

 

       半胱天冬酶结合测定试剂盒包括：

 

      荧光Caspase抑制剂

      500X Hoechst（活细胞DNA染色）

      500X碘化丙啶或500X Nuclear Grean™DCS1（坏死细胞染色）

      洗涤缓冲液

 

 

      图3.在Jurkat细胞中使用FAM-DEVD-FMK（货号: 20100）进行荧光检测活性Caspase 3/7。细胞用1 µM星形孢菌素处理4小时（红色），而未处理的细胞用作对照（绿色）。将对照和处理过的细胞与FAM-DEVD-FMK在37°C下孵育1小时，然后在染色后洗涤一次。荧光强度用NovoCyte™3000流式细胞仪FITC通道测量。

 

       用于测定Caspase 1、2、3 / 7、6、8、9、10或13活性的结合检测试剂盒：

 

 

       4. Caspase酶和磷脂酰丝氨酸（PS）多重测定

 

      Cell Meter™活细胞Caspase 3/7和磷脂酰丝氨酸检测试剂盒旨在通过同时监测哺乳动物细胞中的Caspase 3/7和Annexin V活性来检测凋亡。Annexin V是在钙存在下与磷脂膜结合的蛋白质家族。Annexin V可用于检测在细胞表面表达磷脂酰丝氨酸（PS）的凋亡细胞，PS在细胞表面上的出现是细胞凋亡的初始/中间阶段的普遍指标。Annexin V-dye缀合物通过测量PS的转运来监测细胞凋亡。该试剂盒还提供了一种Hoechst染料，用于标记整个细胞群体的细胞核，以及碘化丙啶染料，用于对坏死细胞进行染色。

 

 

      图4. 荧光图像分析表明，由1 µM星形孢菌素诱导的Jurkat细胞中Caspase 3/7（红色，由TF3-DEVD-FMK染色）和Annexin V（绿色，由膜联蛋白V-iFluor 488™染色）的表达增加。 3个小时。用奥林巴斯荧光显微镜分别通过DAPI，FITC和TRITC通道拍摄细胞的荧光图像（300,000个细胞/孔）。如上所示，合并了从同一细胞群体的每个通道拍摄的单个图像。A：非诱导的对照细胞；B：星形孢菌素诱导的细胞对Caspase 3/7（红色）和Annexin V（绿色）的双重染色；C：星形孢菌素诱导的细胞对Caspase 3/7（红色），Annexin V（绿色）和核（蓝色）的三重染色。

 

      用于测量细胞凋亡的胱天蛋白酶和磷脂酰丝氨酸检测试剂盒：

 

 

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